Anti-Ki-67抗体免疫组化抗体是免疫组织化学（IHC）中用于评估细胞增殖活性的关键试剂，其检测结果的准确性直接影响肿瘤的诊断、分型与预后判断。为确保染色结果可靠、背景清晰、判读客观，必须遵循标准化的操作流程。以下是
Anti-Ki-67抗体免疫组化抗体在免疫组化中的正确使用方法。
一、样本准备
组织固定：手术或活检组织应立即放入10%中性缓冲福尔马林中固定6–24小时，避免过度固定导致抗原封闭。
脱水与包埋：经梯度酒精脱水、二甲苯透明后，用石蜡包埋，制成组织块。
切片：使用切片机将组织切成4–5μm厚的连续切片，贴附于防脱载玻片上，60–65℃烘烤1–2小时，使组织牢固附着。
二、脱蜡与水化
将切片依次浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ（各10分钟）脱蜡，再经100%、95%、80%、70%梯度乙醇水化，最后用蒸馏水冲洗，准备抗原修复。
三、抗原修复
Ki-67抗原需通过热诱导修复（HIER）暴露表位。推荐使用：
修复液：pH9.0EDTA缓冲液或pH6.0柠檬酸缓冲液（根据抗体说明书选择）。
方法：将切片置于修复盒中，加入修复液，使用高压锅、微波炉或水浴锅加热至沸腾，维持15–20分钟，自然冷却至室温，再用PBS缓冲液冲洗3次，每次5分钟。
四、阻断内源性酶与封闭
过氧化物酶阻断：滴加3%过氧化氢溶液，室温孵育10–15分钟，阻断内源性过氧化物酶活性，防止假阳性。
血清封闭：滴加正常非免疫动物血清（如山羊血清），37℃孵育15–30分钟，减少非特异性结合。
五、一抗孵育
抗体稀释：根据说明书将Anti-Ki-67抗体免疫组化抗体用抗体稀释液稀释至合适浓度（浓缩型通常1:50–1:200）。
孵育：滴加一抗于切片上，37℃孵育30–60分钟，或4℃过夜（可增强信号）。
洗涤：用PBS轻轻冲洗3次，每次5分钟。
六、二抗与显色
二抗孵育：滴加酶标二抗（如HRP标记的抗小鼠IgG），37℃孵育30分钟。
显色：滴加DAB显色液，显微镜下控制反应时间（通常1–5分钟），待阳性信号清晰、背景未加深时，立即用蒸馏水终止反应。
七、复染与封片
复染：用苏木素对细胞核进行轻度复染（30秒–1分钟），盐酸酒精分化，氨水返蓝。
脱水透明：经梯度酒精脱水、二甲苯透明后，用中性树胶封片。
八、结果判读
在显微镜下观察，Ki-67阳性细胞核呈棕褐色。选择肿瘤细胞密集区，随机计数至少500–1000个肿瘤细胞，计算阳性细胞百分比（Ki-67指数）。
